熊果酸概述

熊果酸又稱(chēng)烏索酸、烏蘇酸，是從杜鵑花科常綠蔓生灌木熊果中提取的一種五環(huán)三萜類(lèi)化合物，具有特殊的氣味，在無(wú)水乙醇中得大而有光澤的棱晶，而在稀乙醇中得細得像毛似的針晶。mp285℃～288℃，[α]D20+66°(吡啶)，易溶于二氧六環(huán)，吡啶，溶于甲醇、乙醇、丁醇、丁酮，略溶于丙酮，微溶于苯、氯仿、乙醚，不溶于水和石油醚。具有鎮靜、抗炎、抗菌、抗糖尿病、抗潰瘍、降低血糖等多種生物學(xué)效應。近年來(lái)發(fā)現它具有抗致癌、抗促癌、誘導F9畸胎瘤細胞分化和抗血管生成作用，極有可能成為低毒高效的新型抗癌藥物。另外，熊果酸具有明顯的抗氧功能，是一種較強的抗氧化劑，熊果酸的抗氧化作用對人體的抗衰老、皮膚祛斑、祛色素都有積極作用，因而被廣泛地用作醫藥和天然的美白化妝品原料，有實(shí)驗表明熊果酸能抑制花生四烯酸代謝過(guò)程中5-脂氧化酶、環(huán)氧化酶活性，阻止前列腺素與白三烯生成，這可能是熊果酸抑制炎癥反應、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化物的原因。

熊果酸物理化學(xué)性質(zhì)

熔點(diǎn) 283-285°C , 比旋光度 59° (c=0.3, pyridine) , 儲存條件 2-8°C , 水溶性 insoluble , Merck 9890 ,  EPA化學(xué)物質(zhì)信息 Urs-12-en-28-oic acid, 3-hydroxy-, (3.beta.)-(77-52-1)

熊果酸高含量為有光澤的棱柱狀(無(wú)水乙醇)或細毛樣針狀結晶(稀乙醇)，低含量為棕黃色或黃綠色粉末，具特殊的氣味，是存在于天然植物中的一種五環(huán)三萜類(lèi)化合物。熔點(diǎn)283～288℃. 比旋光度[α]D25 +67.5°（C=1，1mol/L氫氧化鉀醇溶液中）。在15℃時(shí)，乙醇（99%）1毫升可溶解10毫克，沸騰1毫升可溶解45毫克。尚易溶于甲醇，丙酮，吡啶，不溶于水和石油醚。

熊果酸的藥理作用

1 抗腫瘤活性 

抗腫瘤活性是熊果酸最主要的藥理作用。多數研究認為,熊果酸通過(guò)化學(xué)預防、抗突變、細胞生長(cháng)抑制和細胞毒等作用來(lái)抑制腫瘤生長(cháng)和擴散。研究表明,熊果酸對人A431腫瘤細胞增殖的抑制作用呈明顯的時(shí)間和劑量依賴(lài)性,這種抑制作用在停藥以后能部分逆轉。熊果酸長(cháng)時(shí)間作用于細胞可表現出 細胞毒和抑制細胞生長(cháng)的雙重作用。熊果酸對酪氨酸激酶的抑制同樣呈劑量依賴(lài)性。 Lee等[1]認為,熊果酸能使腫瘤在生長(cháng)、氧消耗及腫瘤間質(zhì)液壓方面發(fā)生改變。通過(guò)MTT法、促克隆和生長(cháng)延遲實(shí)驗發(fā)現,熊果酸抑制腫瘤作用明顯。用Clark電極室測定發(fā)現,熊果酸能降低細胞耗氧量。FSaò細胞在熊果酸100mg#kg-1的劑量下,其生長(cháng)狀態(tài)被顯著(zhù)抑制,熊果酸誘導的細胞凋亡也顯著(zhù)增加。動(dòng)物實(shí)驗顯示,熊果酸能明顯降低腫瘤間質(zhì)液壓。因此,熊果酸作為腫瘤治療藥具有一些病理生理學(xué)方面的優(yōu)勢,對于熊果酸的臨床應用及進(jìn)一步深入研究有積極的幫助。 熊果酸還能抑制人類(lèi)克隆腫瘤細胞系HCT15。將HCT15細胞用熊果酸進(jìn)行處理,光鏡下發(fā)現許多細胞都開(kāi)始退化,細胞的繁殖能力顯著(zhù)下降。在24~72h期間,死亡細胞的數量明顯增加,大部分細胞都在72h死亡,但是細胞碎片卻很少看到。用熊果酸處理的細胞繁殖能力顯著(zhù)下降,而空白對照組的細胞仍然以幾何方式增殖。熊果酸的細胞毒性比較強,使細胞停滯于G0/G1期,并且使S期的細胞數量逐漸減少,但沒(méi)有凋亡碎片出現。因此認為,熊果酸的抗腫瘤作用是通過(guò)阻滯細胞周期來(lái)實(shí)現的。

2抗白血病活性

熊果酸能有效地抑制P3HR1細胞及慢性髓性白血病細胞K562的增殖。 研究認為,熊果酸的細胞凋亡活性可能與阻止DNA復制起始有關(guān)。熊果酸作用于人肝母細胞癌HEP2細胞,能夠誘導DNA分裂和亞雙倍體細胞及提高細胞色素C的釋放并活化半胱天冬酶(cas-pase),而細胞凋亡正是通過(guò)細胞色素C依賴(lài)的半胱天冬酶活化所介導的。p21WAF1表達的增加說(shuō)明熊果酸誘導的細胞周期阻斷作用可能是由p21WAF1介導的。同時(shí),熊果酸能顯著(zhù)阻止體外SV40DNA在開(kāi)始階段的復制,以及在拓撲異構酶?作用下的DNA的裂解和單鏈DNA(ssDNA)的連接活性。這些結果都說(shuō)明,熊果酸可能是作用于細胞的起始階段阻止復制叉的形成,從而導致細胞周期的停滯。另外,Harmand等在HaCat細胞中也發(fā)現同樣的結論,推測熊果酸誘導的細胞周期停滯可能是由p21WAF1起作用,同時(shí)使392位的絲氨酸磷酸化易位到核內,使p53獲得抗腫瘤活性。 Lauthier等研究認為,熊果酸能減弱人淋巴瘤Daudi細胞活性,同時(shí)還能誘導細胞形態(tài)學(xué)改變、細胞膜不對稱(chēng)缺失、DNA斷裂和核濃縮。熊果酸能增加細胞內鈣離子水平,鈣離子拮抗劑(如維拉帕米)能阻斷這種形式的鈣內流,由此阻斷細胞凋亡的發(fā)生。根據這一現象可以推測,熊果酸可能與糖皮質(zhì)激素類(lèi)受體結合,通過(guò)增加細胞內鈣的水平來(lái)觸發(fā)凋亡

3肝損傷的保護作用 

近年來(lái),關(guān)于三萜類(lèi)天然產(chǎn)物如甘草酸、齊墩果酸等具有抗肝損傷、抗肝纖維化作用的報道非常多,而有關(guān)熊果酸的報道國內遠遠不如國外多。Martin-Aragon等研究發(fā)現,熊果酸對于CCl4誘導的抗氧化酶改變有保護作用。熊果酸能明顯減低CCl4誘導的小鼠血清丙氨酸(ALT)和天冬氨酸(AST)的升高。熊果酸同時(shí)也能逆轉過(guò)氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽還原酶及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活性,以及保持谷胱甘肽體內水平。體外實(shí)驗中,對于CCL4中毒的肝細胞,熊果酸(P<0.01,500mmol/L-1 )能顯著(zhù)降低谷草轉氨酶及乳酸脫氫酶活性,并且發(fā)現熊果酸在羥基化后具有很強的自由基清除活性。熊果酸對乙醇誘導的離體肝細胞毒性具有保護作用。乙醇導致肝細胞生存力下降48%~54%,同時(shí)生化指標如AST,ALT和活化因子蛋白(AP)下降42%~54%。因此,熊果酸通過(guò)作用于這些指標而呈現出劑量依賴(lài)性的保護作用

4抗菌、抗炎及抗病毒作用 

野桐屬植物白背葉Mallotuspeltatus的甲醇提取液中,熊果酸作為主要成分之一對金黃色葡萄球菌、腐生葡萄球菌及大腸桿菌等多種細菌有抑制作用。熊果酸對于細菌的最小抑菌濃度(MIC)為128~2000g/L-1,對真菌則為128g/L-1。該提取液對角叉菜膠和右旋糖酐誘導的鼠爪水腫和棉球誘導的慢性肉芽腫有顯著(zhù)的抗炎活性。研究顯示,該活性可能是熊果酸單獨作用或與β-谷甾醇和脂肪酸協(xié)同發(fā)揮作用。Tapondjou等通過(guò)醋酸扭體實(shí)驗和熱板法實(shí)驗證實(shí),熊果酸和23-羥基熊果酸有類(lèi)似的作用。熊果酸能分別抑制甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(fMLP)及花生四烯酸誘導的超氧化物的產(chǎn)生。將熊果酸和fMLP加入細胞培養液中,熊果酸呈劑量依賴(lài)性抑制由fMLP誘導的45ku蛋白酪氨酸 磷酸化。熊果酸的衍生物還具有抗HIV的作用,熊果酸及其丙二酸衍生物能夠抑制HIV-1蛋白酶,其IC50分別為8和6mmol/L-1。熊果酸還具有殺錐蟲(chóng)活性,在2g/L -1 的濃度下孵育2h后,克氏錐 蟲(chóng)鞭毛體的活動(dòng)被完全抑制.

5抗氧化 

熊果酸是一個(gè)較強的抗氧化劑。能明顯地捕獲 O2-，在肝微粒體和P450單胺氧化酶系中對脂質(zhì)過(guò)氧化均顯示較強的抑制作用。另外，有試驗證明熊果酸對環(huán)氧合酶-2(COX-2）的活性有較強的抑制作用。 此外，熊果酸還具有明顯的抗輻射、鎮靜、抗潰瘍、抗動(dòng)脈粥樣硬化以及安定、降溫、協(xié)同戊巴比妥的催眠作用等多種生物學(xué)效應

6其他藥理活性 

脂質(zhì)體包裹的熊果酸能夠增加人皮膚細胞的神經(jīng)酰胺和膠原的含量,年老引起的皮膚皺褶和干燥是由于真皮膠原和角質(zhì)層神經(jīng)酰胺含量的減少造成的。研究顯示,熊果酸與脂質(zhì)體相結合能增加正常人表皮角質(zhì)形成細胞(NHEK)中神經(jīng)酰胺的含量及真皮膠原細胞的膠原含量。然而,現這一結果與以前維生素A減少NHEK的膠原的結論相反。 Somova等究發(fā)現,熊果酸具有心血管方面的藥理活性。以二辛基硫代丁二酸鈉胰島素抵抗的先天性高血壓大鼠為模型,研究了熊果酸對心血管機能、抗高血脂、促利尿和降血糖活性,以及抗氧化作用的影響。結果表明,熊果酸不具有直接降低血壓的作用,但應用6周后,它能阻止嚴重的高血壓的病情進(jìn)展,這得益于其有效的利尿作用、直接的心臟作用、抗高血脂和降血糖作用。除了抗高血脂作用外,其他作用都是首次報道,機制目前尚未研究。熊果酸能夠作為乙酰膽堿酯酶(AchE)抑制劑,通過(guò)減少膽堿酯酶的降解來(lái)提高膽堿能神經(jīng)的傳導,并且以競爭性/非競爭性方式抑制AchE的活性。熊果酸的Ki值(表示酶與抑制劑之間的密切程度)為6pmol/L-1 ,因此,熊果酸作為有效的AchE抑制劑能用于老年性癡呆癥的治療。

熊果酸在自然界中分布廣泛,資源豐富,具有抗腫瘤、抗肝損傷、抗菌消炎和抗病毒等多種藥理學(xué)活性,熊果酸藥用開(kāi)發(fā)前景廣闊,已被眾多研究機構所重視,有望成為一種高效低毒的多用途新藥。

熊果酸的提取分離 

1、乙醇和甲醇提取 熊果酸的提取一般采用乙醇和甲醇進(jìn)行提取，提取物再進(jìn)行分離純化。一種方法是將提取物減壓濃縮后采用石油醚、氯仿、乙酸乙酯進(jìn)行萃取分離，該工藝成本高，污染嚴重；另一種是將提取液減壓濃縮，用硅膠柱或交聯(lián)葡聚糖凝膠柱分離富集，采用該工藝，柱填料成本高，工藝過(guò)程復雜，并且常用有毒有機溶劑作洗脫劑，污染環(huán)境；此外，采用大孔吸附樹(shù)脂對提取物進(jìn)行分離效果較好。 任秀蓮等研究了用沉淀-吸附法提取苦丁茶中熊果酸的工藝，將苦丁茶先用乙醇提取，提取液用質(zhì)量分數為10%的NaOH溶液堿化至pH值約為10.96%，過(guò)濾除去多酚等雜質(zhì)，沉淀后，濾液先用體 積分數為10%的H2SO4酸化至pH值為4.00，再用相同體積的PH值為4.00的酸性水溶液稀釋?zhuān)玫叫芄岢恋泶之a(chǎn)品；粗產(chǎn)品用甲醇溶解后，將樣品溶液PH值調整為7.07，洗脫液PH值調整為11.0，用D型大孔樹(shù)脂吸附，分步洗脫，收集體積分數為90%乙醇溶液的洗脫液，濃縮結晶得到熊果酸產(chǎn)品。吸附分離后產(chǎn)品純度為90.23%，回收率為98.02%，總回收率89.09%.

2、由含熊果酸的皂甙進(jìn)行水解 有些植物原料中熊果酸以皂甙的形式存在，必須將皂甙水解才能采用溶劑進(jìn)行提取、分離，皂苷可用酸或酶水解，皂苷的水解速率與氫離子濃度有關(guān)，有機酸如質(zhì)量分數20%的醋酸幾乎無(wú)水解作用，在硫酸和磷酸溶液中其解離常數亦較低，同一濃度其催化能力不及鹽酸、溴酸，故常用鹽酸水解。

原春蘭等對地榆中熊果酸進(jìn)行提取時(shí)，先采用乙醇加熱回流提取，放冷、過(guò)濾、回收醇得浸膏，將浸膏用水溶解，然后用石油醚萃取去除脂溶性雜質(zhì)，水層用正丁醇萃取得粗皂苷；粗皂苷用水溶解，加食鹽飽和，用正丁醇萃取，合并正丁醇層用水洗去還原糖，減壓回收正丁醇至干得到精制皂苷；精制皂苷加入體積分數7%HCl和95%乙醇使其溶解，加熱回流使晶體析出，水解液放冷至室溫，抽濾，用水洗滌，沉淀再用無(wú)水乙醇重結晶，得白色針狀結晶熊果酸。

采用超臨界萃取技術(shù)進(jìn)行制備超臨界CO2流體萃取技術(shù)應用到熊果酸提取中，選擇性較高，較好地保持熊果酸的生物活性，有利于提取熊果酸后的原料再利用，有利于節約資源。對于提取高附加值的熊果酸來(lái)說(shuō)具有廣闊的前景。 崔星明等采用超臨界CO2流體萃取蘆筍中熊果酸，超臨界流體提取條件為：萃取壓力40MPa，萃取溫度60℃，CO2流速40 mL/min。 此外，由于熊果酸與原料中其他三萜化合物 （如齊墩果酸）性質(zhì)非常相似，直接分離比較困難，可將熊果酸制備為衍生物再進(jìn)行分離，例如酯化后再進(jìn)行分離，可達到熊果酸與原料中其他三萜化合物的有效分離。分離后再水解，即可得到高純度的熊果酸。

熊果酸的臨床應用

李開(kāi)泉等研究發(fā)現UA在制備治療病毒性肝炎藥物中不論單獨使用，還是與其他藥物配合使 用，只要制備成藥品或保健藥品均具有顯著(zhù)治療 病毒性肝炎的作用。他們以齊墩果酸為對照，用 UA治療甲、乙型急性肝炎102例，劑量為102和 60 mg·d～，平均治療時(shí)間為21 d，治愈率為89．3% ，優(yōu)于同期100例齊墩果酸對照組的療效(68% ，P< 0．01)；臨床試驗證明，UA具有顯著(zhù)而迅速降低谷 丙轉氨酶，消退黃疸，恢復肝功能的作用。服藥3周 后，對21例HBeAg陽(yáng)性患者的轉陰率為61．9% ，對 21例HBsAg陽(yáng)性患者的轉陰率為42．8% ，表明對乙型肝炎也有一定治療作用。另外譚仁祥等 研 究也證實(shí)了UA不但具有治療病毒性肝炎的作用， 它還具有抗抑郁作用，并將含有UA的紫蘇提取物 作為治療抑郁癥的藥物。UA幾乎無(wú)不良反應，相 比西藥的抗抑郁譜窄、毒副作用大，用藥后易復發(fā)和 誘發(fā)自殺傾向等有顯著(zhù)優(yōu)勢。以UA為主要成分的女貞葉提取物制成的膠囊劑主要用于肝腎陰虛、陰 虛陽(yáng)亢癥所致的原發(fā)性高脂血癥，是我國批準的二類(lèi)新藥 。

熊果酸的檢測條件

為了更好分離熊果酸和齊墩果酸，要采用國外著(zhù)名公司的色譜柱，理由該公司在生產(chǎn)過(guò)程中總結所得。

采用安捷倫C18柱 ,以乙腈 :水 (體積比 93:7)溶液為流動(dòng)相 ,用紫外檢測器于210nm處檢測.乙醇溶解，對照品溶解8-12mg/25m。

熊果酸的毒理研究

熊果酸對精子有一定毒性作用，它能破壞膽間橋的肌動(dòng)蛋白，打開(kāi)橋鍵，產(chǎn)生共質(zhì)體，抑制精子的形成, 利用這一作用有望開(kāi)發(fā)成男性避孕藥。

植物熊果酸含量測定標準

(1)色譜條件：硅膠G薄層板;環(huán)己烷-氯仿-乙酸乙酯(20:5:8)為展開(kāi)劑，上行展開(kāi);展距12～18cm;5%硫酸乙醇溶液，110℃加熱5min顯色。
(2)對照品溶液的配制：精密稱(chēng)取熊果酸對照品適量，加無(wú)水乙醇：乙醇(3：2)的混合溶液制成每毫升含1mg的溶液，作為對照品溶液。
(3)樣品溶液的制備：精密稱(chēng)取梔子粉碎樣品20g (炒梔子按得率折合后稱(chēng)取)，置索氏提取器內，加乙醚300ml回流提取至無(wú)色，回收溶劑至干，殘留物加石油醚浸泡2次，每次15ml，約浸泡2min，傾去石油醚，用無(wú)水乙醇-乙醚(2：3)混合液微熱使溶解并定容于5ml量瓶中，作為樣品溶液。
(4)測定：準確吸取樣品溶液及對照品溶液2μl，點(diǎn)于同一薄層板上。按上述色譜條件展開(kāi)，顯色。照薄層掃描法掃描，λS=520nm，λR=700nm;雙波長(cháng)反射法鋸齒掃描;SX=3.0;狹縫：1.20mm×1.2mm;紙速：20mm/min。測得樣品及對照品的吸收度積分值，計算熊果酸含量。

熊果酸安全信息

危險品標志：  Xi
危險類(lèi)別碼：  36/37/38
安全說(shuō)明：  24/25-36-26
WGK Germany：-
F： 10-23